细胞微流体技术使用的微流体设备
再下一步是对反转录后的DNA进行核酸扩增。一种是利用聚合酶链式反应（PCR）的扩增方法，这是指数型的扩增；另一种是体外转录法，这种方法是线性的扩增，但需要对RNA进行多一轮的反转录。完成反转录后便可以对扩增后的DNA文库进行测序。
单细胞RNA测序目前已被广泛应用于检测组织中的复杂的细胞种类、追踪细胞谱系的来源、检测细胞生理状态等方面，大大助力于各项研究：2010年，来自剑桥大学的M.Surani对囊胚期中不同发育阶段的细胞进行了单细胞RNA测序，发现了在这两种状态下细胞的转录水平存在巨大的差异，大多与对总体代谢有重大影响的分子有关[18] ；2016年，来自斯坦福大学的Marius Wernig和Stephen Quake利用单细胞RNA测序技术在不同的时间点对小鼠胚胎成纤维细胞到诱导神经细胞的重编码过程进行了分析，解释了细胞重编码过程中分子的连续性。这项研究对于理解在分化过程中的细胞转录组状态具有重要的意义[17] 。
目前而言，单细胞RNA测序的技术已经被广泛运用于真核生物的多聚A尾m RNA的转录组研究中，但是仍然有很多问题需要解决。比如在进行短序列测序时，很难同时做到维持核酸链的特异性和检测各类亚型之间的差异。在测序过程中，RNA的丢失（50%～60%）会在很大程度上降低转录组分析的全面性[32] 。单细胞RNA测序的敏感度同样也是目前单细胞测序的不足之处，目前在低量的转录组中，很难辨别出技术噪声和生物差异性之间的区别，这使得人们在研究整体的转录水平时会损失很大一部分信息[33] 。此外，对于非真核细胞的单细胞测序研究，比如研究某些具有感染性的病原体，也需要人们在现有的单细胞测序技术上进行改进。
近些年关于单细胞RNA测序的研究使我们了解到，很多细胞层面的未解之谜只能通过单个细胞的研究来回答。我们可以想象，在不久的将来，当人们改进了这些技术性问题后，单细胞RNA测序的技术可以被用于所有类型的细胞转录组研究，人们也将揭示更多的单细胞层面上的未知问题。
单细胞RNA测序的另一个核心技术就是测序技术。测序是指通过物理或化学的方法确定线状生物大分子初级结构的过程。DNA测序指分析特定DNA片段的碱基序列，即腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（G）的排列方式。它是现代测序技术的核心，也是破解各种生物奥秘的关键。
20世纪中期，DNA测序技术刚刚起步，当时所流行的化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序、杂交测序等被统称为第一代测序。其中由Fred Sanger及其同事发明的双脱氧终止法（又称Sanger测序法）是第一代测序中最常被使用的技术。
双脱氧终止法（Sanger测序法）的原理是DNA复制，起反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（d NTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（dd NTP）、测序引物及DNA聚合酶等。由于dd NTP缺少3’-OH基团，不具有和另一个d NTP连接形成磷酸二脂键的能力，可以终止DNA链的延伸。通过在4个平行的测序反应中分别加入不同的dd NTP，DNA链会分别在A、G、C、T位终止，于是会形成不同长度的DNA片段。随后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳区分开长度相差为一个核苷酸的DNA分子，于是便可以读出DNA序列[35] 。
2000年，人类基因组计划的草图完成了。传统的第一代测序已经不能满足对大规模基因组进行测序的需求，此时新一代测序的技术在传统科学和商业界的推动下应运而生。
第二代测序的核心技术是边合成边测序，即通过捕捉新合成的核酸末端的标记来确定DNA的序列，与Sanger测序法相比具有更快的测序速度。第二代测序技术最显著的特征是高通量，能够一次性对上百万条DNA进行测序，使DNA测序的成本降低到了以前的千分之一。采用大规模平行测序平台的第二代测序技术，打破了以往大型测序中心对测序产业的垄断，使DNA测序费用降到了以往的百分之一。第二代测序技术的发展使人们能用低廉的价格更加全面地研究基因组、转录组、表观遗传等组学之间的关系。目前市面上主要的第二代测序平台有罗氏公司的454焦磷酸测序、Illumina公司的Hi Seq和Life Technologies公司的SOLi D。Illumina是单细胞RNA测序最常使用的平台，整个测序分为4个步骤：文库制备、核酸簇生成、DNA片段测序、数据分析[36] 。
近几年来，第三代测序技术的发展势头十分猛烈，与第二代测序技术不同的是，第三代测序技术不需要进行PCR扩增。目前盛行的第三代测序技术有Helico Bio Science的单分子测序技术、Pacifc Bioscience的SMRT技术和Oxford的Nanopore（纳米孔单分子测序）技术。Nanopore作为最常用的第三代测序技术，与其他利用“边合成边测序”原理的技术都不同。该公司利用一种经过特殊设计的纳米孔，将核酸外切酶依附在孔的外表面，将一种合成的环糊精通过共价键安装在孔的内表面，充当传感器的角色。当DNA分子从孔中经过时，会使流经纳米孔的电流强度发生变化，再利用灵敏的电子设备检测到这些变化，从而鉴定出这些碱基[37] 。
对于测序而言，测序技术的应用只是其得到序列数据的一种方式，在得到数据后更重要的步骤是对这些数据进行分析且得出对实验有用的结论。无论是大规模细胞还是单细胞的转录组测序，目前其分析的流程都大同小异。
第一步都是序列比对和了解片段的测序深度。所谓序列比对就是将测序后的结果与已有数据库中的模板序列进行比对，再将与之匹配的模板序列的模板信息安置到测序后的序列上。第二步是要对比对后的序列进行质量控制，主要关注基因文库的质量是否能够满足后续分析的需要；在单细胞RNA测序中，还需要关注单个细胞的RNA是否被降解。第三步是在确定得到质量过关的测序数据后，对测序的深度进行标准化处理，以确保在分析时不同批次的数据具有相近的测序深度。以上步骤我们称之为测序数据的上游分析。
下游的分析在大规模细胞测序和单细胞测序中并无差异。首先我们需要对令人疑惑的因素进行分析，利用回归分析的手段找出细胞或样本之间的潜在差异。其次便可以用聚类分析的手段对细胞类型进行鉴定。最后利用差异表达分析工具分析不同细胞类别的特征。得到了以上步骤的结果后，我们便可以进行更加复杂的分析和模型构建，如基因调控网络分析、单细胞的转录动力学分析等[38] 。
细胞图谱的绘制不仅需要强大的单细胞测序技术，还需要依靠多种全新的标记和染色技术来明确特定细胞的空间坐标。近年来，激光显微切割和原位荧光杂交技术也在趋于单细胞化，大大提高了空间分辨率。而组织透明化技术为在组织中精确定位细胞提供了可能。
如上文所说，激光显微切割是一项自动化的样本预处理技术，这项技术能够在显微镜下从混合的细胞群体中分离出特定的细胞，而这种从复杂组织中分离纯化单个细胞的技术能够提高基因组分析的精确度。在显微镜下，通过细胞识别软件的处理，组织薄片中的细胞可被单个区分开，因此可以运用超强脉冲激光对组织直接进行切割。
近年来，激光显微切割技术的发展使激光切割的宽度能够少于1微米，因此目标细胞不会被激光束所影响，甚至活细胞也不会被激光束的切割所损伤，在适当操作的情况下，激光切割后的细胞仍然可以被用来克隆或重新培养[39] 。激光显微切割技术常被用来从组织、血液甚至精子样本中分离少量细胞或单个细胞。这些细胞能够通过形态学、免疫组化染色、原位杂交的方法被选择且确定位置。
目前，已有大量研究使用了激光切割技术。2012年，华盛顿大学的Allen Jones和爱丁堡大学的Seth Grant共同发表了他们关于人类大脑转录组学的细胞图谱研究。他们将数字化的大脑分子图谱集成的方法引用到了模式生物上，利用激光切割的方法筛选出目标样本，发明了一种能够在样本中构建全面的转录组图谱的技术[40] 。2014年，Allen大脑研究所的John Hohmann和Ed Lein利用激光显微切割技术，对妊娠中期的人类大脑样本构建了全面的转录组图谱，为人们了解大脑的发育过程提供了丰富的信息资源[41] 。2014年，瑞典卡洛琳斯卡研究院的Carlos Ibanez和Sten Linnarsson将激光显微切割技术与大规模RNA测序相结合，对小鼠的内侧神经节突起进行了空间相关转录组分析，他们在中间神经元成熟的过程中发现了有明显差异的祖细胞群，这揭示了哺乳动物中枢神经系统的基因表达的空间异质性[42] 。2016年，中科院上海细胞与生化研究所的景乃禾团队利用激光显微切割技术从小鼠的单个胚胎中分离出目标位置的细胞群，进行了单细胞RNA测序，揭示了小鼠胚胎原肠胚期的空间转录组信息和细胞身份[43] 。